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| 虫草茵丝提取物对DMN诱导肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞通透性影响 |
| 时间: 2007-08-25 12:52:57 来源: 中国新药与临床杂志，2006年9月，第25卷第9期 作者: 点击: 7484 |
[关键词] 肝硬化， 实验性；细胞膜通透性；大鼠；二甲基亚硝胺；肝窦内皮细胞； 窗孔；小窝蛋白1；虫草茵丝提取物
[摘要] 目的：研究二甲基亚硝胺(DMN)诱导大鼠肝纤维化模型肝窦内皮细胞(SECs)通透性变化模式， 以及虫草菌丝提取物(CME)对SECs通透性的影响， 以阐明其抗肝纤维化的作用机制。方法：采用DMN 10μg•kg-1腹腔注射，每周3次，连续4 wk的方法制作大鼠肝纤维化模型。按10 mg•kg-1•d-1剂量给予CME干预和治疗模型大鼠，qd，连续2 wk和4 wk。透射电镜观察肝组织超微结构。免疫组织化学染色法观察肝窦壁CD31和小窝蛋白1(Cav-1)表达。结果： 正常肝窦壁SECs有许多窗孔，CD31和Cav--1呈现弱阳性染色。给予DMN刺激后，模型组大鼠肝窦壁SECs窗孔数量逐渐减少，CD31和Cav-1阳性染色细胞逐渐增多，至4 wk末时到达峰值；停止DMN刺激后，模型对照组大鼠肝窦壁SECs窗孔数量逐渐增多，CD31和Cav-1阳性染色细胞逐渐减少。经2 wk和4 wk处理后，与模型组和模型对照组比较，CME预防组和治疗组大鼠肝窦壁SECs窗孔数量显著增多，CD31和Cav-1阳性染色细胞逐渐显著减少。结论：在DMN诱导大鼠肝纤维化形成过程中，SECs表型发生变化，其通透性模式由以窗孔运送为主转变为以小窝运送为主，使通透性减少。CME能够改善SECs通透性，这可能是其抗肝纤维化作用机制之一。
[中图分类号] R36；R282．7 [文献标识码] A
Efect of Cordyceps mycelia extract on hepatic sinusoidal endothelial cells permeabilityin dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in ratsTANG Zhi—peng ，LIU Ping ，WANG Xian—bo(J．Department of Gastroenterology，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine，SHANGHAI 200032，China；2．Institute ofLiver Diseases，Shanghai University of Traditional Chi—nese Medicine ，SHANGHA，201203，China)[KEY WORDS] liver cirrhosis，experimental；cell membrane permeability；rats； dimethylnitr0samine；hepatic sinusoidal endothelial cells；fenestrae；caveolin—l；Cordyceps mycelia extract[ABSTRACT] AIM：To study the mode of hepatic sinusoidal endothelial cells(SECs)permeability indimethylnitr0samine (DMN)一induced liver fibrosis in rats and the effect of Cordyceps mycelia extract(CME)on SECs permeability in order to explore the anti—fibrosis mechanism of CME． METHODS：The liver fibrosismodel was established by peritoneal injection of DMN (at a dose of 10 mg•kg～，3 times•wk～，for 4 wk)in rats．The rats of the CME—prevented group and CME—treated group were administrated with CME at a dose of 1 0 mL•kg •d～，qd， f0r 2 and 4 wk．Uhrastructure of liver tissue was observed under transmission electron microscope(TEM)．CD3 1 and cavedin一1(Cav-1) expressions of sinusoid walls were assessed with immunohistochemicaltechnique． RESULTS：There were many fenestrae．a little CD3 1 and Cav-1 positive staining in normal liversinusoidal walls．When exposed to DMN． the number of fenestrae gradually decreased and the number of CD3 1and Cav-1 positive staining gradually increased．The strongest positive staining of them displayed in the 4 wkmodel rats．When DMN was withdrawn．the number of fenestrae gradually increased and the number of CD3 1and Cav-1 positive staining gradually decreased in the model control rats．Atier 2 and 4 wk treatment．the Bum—ber of fenestrae significantly increased， and the number of CD3 1 and Cav-1 positive staining significantly de—creased in the CME--prevented and CME--treated group compared to model and model control group respectively(CME—prevented us model group：CD31 positive area (％)：1．53±0．41 us 3．94±0．70 (2 wk)，2．51±0．77us 6．09± 1．16 (4 wk)；Cav-1 positive area (％)：2．05±0．63 us 3．98±0．94 (2 wk)，2．27±0．78 us 7．69±1．71(4 wk)．CME—treated us model control group：CD31 positive area (％)：2．01±0．67 us 4．35±1．02 (2 wk)，1．16±0．28 us 3．01±0．52 (4 wk)；Cav-1 positive area (％)：2．01±0．67 us 5．62± 1．39 (2 wk)，1．61±0．35 us 3．01±0．94 (4 wk)，P <0．05)． C0NCLUSION：During the development of DMN—induced liver ratfibrosis，phenotype shift of SECs results in permeability decrease due to the mode of permeability changes frompredominant—fenestrae transport to predominant—caveolae transport．CME is able to increase SECs permeability，which is responsible to one of the mechanisms of preventing and treating liver injury and reversing liver fibrosis．
肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells，SECs)表型变化在肝纤维化形成过程中起重要作用。SECs通透性受到细胞内结构即窗孔和小窝(caveolae)的调控，各种病因引起的肝损伤均可以导致SECs物质运送通道方式的变化。冬虫夏草(Cordyceps sinensis Berk．Sacc．)是麦角科虫草属真菌寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫后形成的子座及干燥虫体，其药用正式记载于清代赵学敏著《本草纲目拾遗》，具有益精髓和补虚损等功效。既往临床和实验结果表明，冬虫夏草和虫草菌丝制剂治疗肝纤维化和肝硬化具有一定效果。本文研究二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)诱导大鼠肝纤维化模型SECs通透性变化模式，以及虫草菌丝提取物(Cordyceps mycelia extract，CME)对SECs通透性的影响，以阐明其抗肝纤维化的作用机制。
材料与方法
材料Wistar雄性大鼠60只，清洁级，体重(150±s 10)g， 中科院上海实验动物中心提供。DMN，东京化成工业株式会社产品，批号：MAL05。兔抗小窝蛋白1(Cav-1)多克隆抗体，Santa CrusBiotechnology公司产品， 批号： D232 鼠抗CD31／PECAM-1单克隆抗体，Antibody DiagnosticaInc公司产品，批号：0201。免疫组织化学二步法抗兔或抗鼠的二抗检测试剂(HRP)，Antibody Dagnostica Inc公司产品， 批号：0201 液体DAB酶底物显色试剂盒，Antibody Diagnostica Inc公司产品，批号：0203。HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统，同济医大干屏影像工程公司产品。CME：由上海中医药大学肝病研究所制备。
模型制备和分组处理 参照JENKINS等介绍的制备DMN诱导大鼠肝纤维化模型的方法。取Wistar大鼠40只， 分为4组， 按DMN 10μg•kg-1剂量(用生理盐水稀释)处理动物，腹腔注射，每周连续3 d，每日1次，共4 wk。其中， (1)模型组：予生理盐水2 ml灌胃，每日1次，分别于造模后2 wk及4 wk各取5只模型大鼠观察。 (2)模型对照组：予生理盐水2 ml灌胃，每日1次，分别于停止造模后2 wk及4 wk各取5只模型大鼠观察。 (3)CME预防组：在造模的同时对10只大鼠给予CME干预处理，按10 mg•kg-1•d-1 剂量灌胃，每日1次；分别于预防给药后2 wk及4 wk各取5只大鼠观察。 (4)CME治疗组：大鼠经4 wk造模成功后， 取10只模型大鼠给予CME治疗，用药剂量与方法同CME预防组，分别于治疗给药后2 wk及4 wk各取5只大鼠观察。 (5)正常对照组：大鼠20只，予生理盐水2 mL灌胃，每日1次，分别于2，4，6及8 wk各取5只大鼠观察。
透射电镜超微结构检测 肝组织于2.5％ 戊二醛磷酸缓冲固定液中固定2 h，经0.1 mol•L-1二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)冲洗后入1％锇酸缓冲固定液中固定2 h，饱和醋酸铀块染，常规脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片定位，分别于1区(汇管区)、3区(中央静脉附近)和2区(1区和3区之间)超薄切片，柠檬酸铅染色。
免疫组织化学染色大鼠肝组织予4％ 中性甲醛溶液固定，24 h后逐级乙醇脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，4μm厚切片。石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸缓冲液煮20 min， 加0.3％H2O2室温10 min，再用0.1％胰蛋白酶消化，37 ℃，30 min；加一抗鼠抗CD31单克隆抗体或兔抗Cav-1多克隆抗体，置湿盒4 ℃过夜，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3次，每次5 min；加抗兔或抗鼠的二抗检测试剂(HRP)，37 ℃，30 min；二氨基联苯胺(DAB)显色5 min，水洗，烘干， 中性树胶封片。以PBS替代一抗作为空白对照染色。
图象定量分析：免疫组化染色切片每组各取3张，随机选择5个不同视野，在20×10放大倍数下， 测定标准测量窗口中肝窦擘阳性区域的面积比。
统计学处理 计量资料用 ±S表示，用计算机统计软件SPSS10．0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较：P<0．05表示具有显著差异。
结 果
CME对SECs窗孔数量的影响 透射电镜超微结构观察，正常大鼠肝窦位于肝板之间，可见较宽的腔隙，SECs有许多窗孔，内皮下无基底膜。在DMN造模2 wk末，SECs窗孔数减少(失窗孔)较为明显，但内皮下基底膜仍未形成。造模4 wk时几乎未见充盈的肝窦，SECs窗孔消失，内皮下已有完整的基底膜形成。停止造模2 wk末SECs可见少量窗孔，内皮下基底膜的形成有所减轻，而停止造模4 wk末可见充盈的肝窦，SECs窗孔数节增加，并且内皮下基底膜明显减少。
CME预防2 wk末大鼠SECs窗孔数量减少程度较轻，CME预防4 wk末SECs窗孔数量比同期模型组多，内皮下基底膜形成程度也较轻。CME治疗2 wk后SECs窗孔重新出现，数量多于同期模型对照大鼠；CME治疗4 wk时可见大量的窗孔， 内皮下基底膜不连续、甚至消失，多数肝窦结构恢复正常。
CME对肝窦壁CD31表达的影响 正常组大鼠CD31阳性染色见于汇管区血管壁，肝窦壁弱阳性染色。DMN造模2 wk后，肝窦壁阳性染色增强，至造模4 wk时达到峰值。停止造模2 wk后肝窦壁CD31阳性染色逐渐减弱，但在停止造模4 wk时阳性染色仍稍强于正常组。
与同期模型组比较，在2 wk和4 wk时CME预防组大鼠肝窦壁CD31阳性染色均较模型组减弱(P<0．05) 见表1。
与同期模型对照组比较，在CME治疗2 wk和4 wk后大鼠肝窦壁CD31阳性表达均显著减弱(P<0．05)见表2。
CME对肝窦壁Cav-1表达的影响 正常组大鼠Cav-1阳性染色见于汇管区血管壁，肝窦壁呈弱阳性染色。DMN造模2 wk后，肝小叶中央静脉附近肝窦壁可见较强阳性染色，至造模4 wk时达到峰值；停止DMN造模2 wk后肝窦壁Cav-1阳性染色逐渐减弱，但在停止造模4 wk时阳性染色仍稍强于正常组。
在CME预防实验中，与同期模型组大鼠比较，在2 wk和4 wk末CME预防组Cav-1阳性染色均较模型组减弱(P<0．05)。见表3。
在CME治疗实验中，与同期模型对照组比较，CME治疗2 wk和4 wk时肝窦擘Cav-1阳性染色均减弱(P<0．05)。见表4。
讨 论
SECs是肝窦壁的主要组成部分，具有至关重要的物质运送功能。SECs通透性受到2种细胞内结构即窗孔和小窝的调节。本实验发现，在DMN诱导大鼠肝纤维化形成过程中，SECs表型发生变化，其通透性模式由以窗孔运送为主转变为以小窝运送为主，CME能够改善SECs通透性。
正常SECs的通透性是以窗孔运送为主， 以维持正常的肝脏微生态平衡。SECs属于肝脏非实质性细胞，衬在肝窦内壁，位居肝窦腔和Disse间隙之间。正常SECs的特征是拥有大量无隔膜的窗孔，内皮下缺乏基底膜，是非连续性内皮细胞，与血管内皮细胞(连续性内皮细胞)存在明显差异。SECs窗孔的直径为150～175 nm，数量为9～13个•μm， 占细胞表面的6％ ～8％。依据窗孔的形态学和生理学证据，成组的窗孔具有动态滤器(dynamic filter)和选择性筛(selective sieve)作用，过滤在肝窦腔和Disser间隙之间交换的液体、溶质和微粒，只允许比窗孔小的微粒到达实质细胞或离开Disser间隙。这种双向性交换，使肝窦血液与实质细胞表面微绒毛之间得到密切接触。因此，以窗孔运送为主的物质运送方式，其通透性较好。
小窝介导大分子跨细胞转运(transcytosis)作用。小窝是富含胆固醇和糖基磷脂质膜微区，呈烧瓶状，直径约为50～100 nm，以单独或成串方式存在于质膜上，包括了95％的细胞表面微囊(vesicles)，约占15％的SECs体积。Cav-1是一种21 826 u的膜蛋白，属于小窝的包被蛋白，分子中段具有一个疏水性区域，形成发夹样结构，亲水性N末端和C末端位于胞浆中。小窝的主要生物学作用除了作为可移动的细胞信号转导平台之外，更重要的是介导跨膜转运作用， 即小窝将大分子从血管腔侧运输到内皮下间隙。已经证实白蛋白、胰岛素、初始低密度脂蛋白(LDL)和已修饰的LDL等分子是经小窝跨细胞转运的。Cav-1在此过程中起中心作用，通过其酪氨酸磷酸化作用而发挥小窝释放复合体(caveolar release complex)成分的支架功能，使小窝与质膜分离，而进入胞浆。小窝微囊的大小和存在于小窝中的特殊受体是调控内皮细胞对特殊分子的选择性通透性的重要因素。在正常肝脏内，物质运送方式是以窗孔运送为主，而以小窝运送为次。
在肝纤维化形成过程中，SECs表型发生变化，其通透性模式由以窗孔运送为主转变为以小窝运送为主。本研究结果显示，在DMN诱导大鼠肝纤维化过程中，SECs窗孔数量逐渐减少以至消失，肝窦壁CD31表达增多，CD31是分子质量为128 973 u的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，是一种血管细胞黏附分子，而CD31表达是SECs失窗孔的标志物⋯。与此同时，肝窦壁Cav-1阳性染色细胞显著增多，而Cav-1表达上调是连续性内皮细胞的标志物。曾有报道在四氯化碳和胆管结扎诱导的大鼠肝硬化模型中，肝窦壁Cav-1表达增加。在本研究中，我们发现DMN诱导大鼠肝纤维化模型中的肝窦壁Cav-1表达也增加。提示SECs由非连续性内皮细胞转变为连续性内皮细胞，其物质运送通道方式也随之变化，由以窗孔运送为主转变为以小窝运送为主，所能够运送的物质也出现相应变化，通透性减少，肝细胞和其他非实质性细胞处于缺血缺氧状态，并且所合成和分泌的化学物、以及代谢产物不容易进入血液循环，这就会加重肝脏病理性损伤，促进肝纤维化形成过程。本研究也发现，这种病理性的SECs表型变化是可逆性的， 当撤除DMN刺激之后，SECs逐渐恢复窗孔，Cav-1阳性染色细胞逐渐减少，由连续性内皮细胞转变为非连续性内皮细胞，其物质运送通道方式也随之变化，即由以小窝运送为主转变为以窗孔运送为主，所能够运送的物质也出现相应变化。因此，增加SECs通透性可以改善病变部位的缺血缺氧状态，更好地清除代谢产物，因而有助于修复肝损伤，逆转肝纤维化进程。
人工培养的虫草菌丝与天然冬虫夏草具有类似功效。本研究发现，CME能够预防和逆转DMN诱导的大鼠SECs表型变化，增加窗孔数量，同时减少Cav-1表达，使连续性内皮细胞转变为非连续性内皮细胞，恢复以窗孔运送为主的物质转运模式，能够增加通透性，增加肝细胞和其他非实质性细胞供血供氧，这可能是其防治肝损伤和逆转肝纤维化的作用机制之一。
总之， 在DMN诱导大鼠肝纤维化形成过程中，SECs表型发生变化，其通透性模式由以窗孔运送为主转变为以小窝运送为主，通透性减少。CME能够改善SECs通透性，这可能是其防治肝损伤和逆转肝纤维化的作用机制之一。
[参考文献]（略） |
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