[关键词] 　纤维变性;转化生长因子β;血小板源性生长因子;肝硬化; 冬虫夏草
[摘要] 　目的:探讨虫草菌丝对实验性慢性肝炎纤维化形成的抑制作用及其可能的作用机制。方法:以CCl₄及乙醇诱导大鼠肝纤维化模型,自造模10 d后给予虫草菌丝悬浊液灌胃,同时设立正常对照组和模型对照组。于造模9 wk 后处死全部大鼠,取血及肝组织标本。使用HE 染色法观察肝组织形态学变化和肝纤维化病理学分级,生化及放免法测定血清AL T ,AST ,透明质酸(HA) ,板层素(LN) 含量,使用免疫组化法及原位杂交法观察α-平滑肌动蛋白(α-SMA) ,转化生长因子β₁ ( TGFβ₁) ,血小板衍生生长因子( PDGF) , Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白或mRNA表达情况。结果:与模型组相比,虫草组大鼠血清HA ,LN ,AST ,AL T 含量均显著下降(202 ±s 79 vs316 ±94 ; 50 ±3 vs 60 ±10 ; 86 ±34 vs 224 ±179 ;147 ±60 vs 273 ±130 ; P < 0. 05) 。肝组织表达α-SMA , TGFβ₁ , TGFβ₁ mRNA , Ⅰ型胶原mRNA ,PDGF 均显著减少(0. 2 ±0. 14 vs 1. 7 ±1. 4 ; 1. 7 ±0. 5 vs 3. 2 ±1. 2 ; 1. 1 ±0. 8 vs 2. 6 ±1. 4 ; 0. 9 ±0. 4 vs 1. 9 ±0. 7 , P < 0. 05) 。Ⅲ型胶原mRNA 表达呈下调趋势( 0. 4 ±0. 3 vs 1. 0 ±0. 7 , P =0. 0695) 。而PDGFmRNA 的表达下调则不明显(0. 4±0. 3 vs 0. 7 ±0. 5 , P > 0. 05) 。结论:虫草菌丝能够抑制慢性肝炎纤维化的形成,延缓其向肝硬化的发展,并显著改善肝功能。其抑制肝纤维化形成的作用机制可能与抑制TGFβ₁ 表达,从而下调PDGF表达,抑制HSC 活化,减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成有关。
[中图分类号] 　R979. 5 ; R965. 1
[文献标识码] 　A　　
慢性肝炎在我国有较高的发病率,且发病年龄偏低,起病隐袭,病程迁延。病人常在30～40 a 即进展为不可逆转的肝硬化,并发上消化道出血、肝性脑病、顽固性腹水,反复发作,严重影响病人的生存质量,危害病人的生命安全。肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化发展的必经途径,具有持续时间长、可逆转的特点。如能得到有效治疗,则可防止或延缓慢性肝炎向肝硬化的发展。因而肝纤维化防治具有极其重要的临床意义。我国传统的中医药在肝纤维化的防治领域具有独特的优势。已有一些中药为临床和实验研究证实有抗纤维化的作用。其中虫草菌丝是受到广泛关注的一种。但其确切的作用机制尚不完全清楚。本研究复制了慢性肝炎→肝纤维化→肝硬化的动物模型,并给予虫草菌丝干预,以观察其对这一病变过程的阻断作用。同时我们在蛋白和mR-NA 水平设置了一系列指标,旨在深入探讨其作用机制,为延缓或预防慢性肝病向肝纤维化、肝硬化发展的临床治疗提供理论依据。
材料与方法材料　
Wistar 大鼠37 只,雌雄各半,体重(275 ±s25) g ,购自重庆医科大学实验动物中心。透明质酸(HA) 、板层素(LN) 放免试剂盒由上海海军医学研究所提供。血小板衍生生长因子( PDGP) mRNA ,转化生长因子β₁ ( TGFβ₁ ) mRNA , Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA 原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。抗TGFβ₁ 单克隆抗体,抗PDGF 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司。抗α2平滑肌动蛋白(α-SMA) 单克隆抗体由福州迈新公司提供。虫草菌丝由保定制药厂提供。CCl₄及无水乙醇购自本校设备科。
方法
1 　模型的建立与分组　Wistar 大鼠37 只,体重(275 ±s 25) g ,分为3 组,其中模型对照组(模型组)20 只,虫草菌丝组(虫草组) 10 只。(根据预实验结果,模型对照组有较高的死亡率,因而预先分配较多的样本量) 。另设正常对照组7 只。将CCl₄及色拉油混合制成40 %溶液,给予模型组及虫草组大鼠皮下注射,首次剂量为0. 5 mL•100 g^-1体重,以后为0. 3 mL•100 g ^-1体重,每周2 次,同时给予5 %乙醇作为唯一饮料自由饮用,对照组给予0. 5 mol•L^-1磷酸缓冲液( PBS) 0. 3 mL•100 g^-1体重,皮下注射并自由饮水,实验开始10 d 后,模型组随机处死2只大鼠,取肝组织作石蜡切片HE 染色观察病理学变化。虫草组同时给予33 %虫草菌丝生理盐水悬浊液1. 5 mL •100 g^-1体重(折合虫草菌丝0. 5 g•100 g^-1体重) 每日灌胃,其余模型组及正常对照组大鼠给予生理盐水1. 5 mL•100 g ^-1每日灌胃。给药过程持续9 wk 。整个实验过程中,模型组死亡12只(其中2 只为随机处死) ,存活8 只。虫草组死亡4 只,存活6 只。正常对照组大鼠无死亡。9 wk 末处死全部存活大鼠。
2 　血液生化及组织学检查　以0. 5 %异戊巴比妥钠0. 4 mL•100g ^-1体重,腹腔注射,待动物麻醉后,体外心脏采血5 mL ,血细胞自然沉降后,取血清1～2 mL ,4 ℃冰箱保存待检。打开腹腔,取肝右叶,切取肝组织1 cm ×1 cm ×3 mm ,置于含0. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC) 的4 %多聚甲醛0. 1 mol •L^-1PBS 固定液中固定。24 h 内石蜡包埋、切片。使用EX7 全自动生化测定仪测定血清ALT ,AST 含量。使用放免法检测血清HA ,LN 含量,操作步骤参照试剂盒说明。常规HE 染色观察肝组织形态。免疫组织化学检测采用S-P 法。使用试剂盒中自带片为阳性对照。以0. 5 mol•L^-1 PBS 代替第一抗体作为空白对照。
3 　原位杂交检测　切片经二甲苯脱蜡,用梯度酒精及蒸馏水清洗。滴加H₂O₂ ,室温下搁置10 min。滴加胃蛋白酶,37 ℃温育15 min ,0. 5 mol•L^-1 PBS 洗涤5 min ×3 次,蒸馏水洗涤1 次。滴加原位杂交预杂交液, 37 ℃温育2 h 。滴加杂交液( 含探针) ,37 °C温育过夜。次日,滴加5 %非免疫牛血清封闭液,37 ℃温育50 min。分别滴加抗地高辛兔IgG及生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃各温育20 min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物,37 ℃温育20 min ,0. 5 mol•L ^-1 PBS 洗涤5 min ×4 次。滴加显色剂,苏木精复染,酸酒精分色,水洗,烘干。二甲苯透明,中性树胶封片,以预杂交液取代探针作为空白对照。
4 　免疫组化及原位杂交染色结果评定　α-SMA 染色结果使用Gorch 评定法 ,即设空白对照为( - ) ,阳性对照为( + + ) ,介于两者之间为( + ) 。其余各项免疫组化及原位杂交染色结果换算为显色指数,方法参照文献 。具体为:按显色程度分弱、中、强3 种,分别用+ , + + 和+ + + 表示。按显色范围分为: + 为显色范围占肝脏< 1/ 4 ; + + 为显色范围占肝脏1/ 4～2/ 4 ; + + + 为显色范围占肝脏2/ 4～3/4 ; + + + + 为显色范围占肝脏> 3/ 4 。并将显色程度和范围换算成显色指数= 显色程度×显色范围( + 为1 , + + 为2 , + + + 为3 , + + + + 为4) 。
2 名评分员分别对切片染色结果进行盲法评分,每张切片选取10 个高倍视野,计算显色范围及强度,换算成显色指数,取2 名评分员计算结果的均数为最终显色指数。
5 　肝组织纤维增生程度分级评定标准　参照文献 。具体为:0 级———正常肝组织。Ⅰ级———少量胶原纤维自汇管区或中央静脉向外延伸。Ⅱ级———纤维延伸明显,但未包绕整个肝小叶。Ⅲ级———纤维互相连接包绕整个肝小叶。Ⅳ级———纤维分割肝小叶成假小叶,但以大方型假小叶为主。Ⅴ级———假小叶中大方型假小叶和小圆型假小叶各占50 %。Ⅵ级———肝内布满小圆型假小叶,其间布满粗大增生的纤维组织。
统计学处理　所有数据均使用SAS 软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差( x ±s) 表示,2 组间比较使用t 检验。等级资料的假设检验使用秩和检验。
结果
肝组织形态学变化  HE 染色显示,造模10 d 后处死的2 只大鼠肝组织可见肝细胞广泛脂肪变性,中央静脉、汇管区大量炎性细胞浸润,并可见少数点状坏死。病变符合轻度慢性肝炎诊断标准。9 wk后,正常对照组肝小叶结构完整,无变性、坏死、炎性细胞浸润及纤维组织增生。模型组可见大量纤维组织增生,包绕分割再生肝细胞形成假小叶,增生肝细胞再度脂肪变性。部分未形成假小叶的切片可见肝细胞广泛脂肪变性,仅少量肝细胞残存。纤维组织由中央静脉或汇管区向外延伸,增生程度不等。虫草组纤维组织增生较模型组为少,未见假小叶形成。肝组织广泛再生,且再生肝细胞的脂肪变性亦较模型组显著减轻,见图1 。
 
虫草菌丝对肝脏纤维组织增生的影响　模型组50 %达纤维化分级Ⅵ, Ⅴ级,即伴有假小叶形成,而虫草组纤维增生程度仅为Ⅰ, Ⅱ级,较模型组减轻。但统计学处理差异无显著意义,见表1 。
 
虫草菌丝对血清ALT, AST, HA,LN的影响　与模型组相比,虫草组血清HA ,LN ,AL T ,AST 均显著下降( P < 0. 05) 。与正常组相比,虫草组血清AL T ,AST 差异无显著性( P > 0. 05) 。见表2 。
 
虫草菌丝对肝组织α-SMA 表达的影响　虫草组与模型组相比α-SMA 阳染强度显著降低( P < 0. 05) 。见表3 。
 
虫草菌丝对Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA 表达的影响　虫草组Ⅰ型前胶原mRNA 显色指数明显低于模型组( P < 0. 05) 。2 组Ⅲ型胶原mRNA 显色指数经统计学处理差异无显著意义( P > 0. 05) 。见表4 。
 
虫草菌丝对肝组织TGFβ₁ 及其mRNA, PDGF 及其mRNA表达的影响　虫草组肝组织PDGF , TGFβ₁及其mRNA 显色指数均显著低于模型组(分别为P< 0. 01 ; P < 0. 05 ; P < 0. 05) 。2 组间PDGFmRNA显色指数经统计学处理,差异无显著意义,见表4 。

讨论　　
虫草菌丝对肝纤维化的防治作用已被一些报道所证实。本研究在慢性肝炎阶段给药,观察虫草菌丝对肝纤维化形成的抑制作用、对肝功能的改善作用及其对α-SMA , TGFβ₁ , PDGF , Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA 表达的影响。
造模10 d 后,动物肝组织出现广泛的脂肪变性、炎细胞浸润及点状坏死。病变符合轻度慢性肝炎的诊断标准。
9 wk 后模型组50 %达纤维化分级Ⅳ, Ⅴ级,即伴有假小叶形成,而虫草组纤维增生程度仅为Ⅰ, Ⅱ级。尽管统计学处理未见显著差异,但仍能看出虫草组纤维增生较模型组减轻。且虫草组血清HA 和LN 含量显著低于模型组,肝组织Ⅰ型前胶原mRNA 表达亦明显少于模型组。说明虫草菌丝可抑制慢性肝损伤后肝纤维化形成。虫草组血清ALT ,AST 显著低于模型组,且与正常组无显著差异,说明虫草菌丝对肝功能有显著改善作用。
肝星状细胞(HSC) 是肝纤维化发生细胞机制的重要环节。活化的HSC 是肝纤维化时细胞外基质(ECM) 成分最主要的细胞来源。α-SMA 是公认的HSC 活化标志。实验中我们发现,在已形成慢性肝炎的基础上给予虫草菌丝进行干预治疗,大鼠肝组织α-SMA 的表达显著少于模型对照组。说明在慢性肝损伤过程中应用虫草菌丝可抑制HSC 的活化与增殖,可能是其抗纤维化作用的机制之一。
TGFβ₁ 在肝纤维化的发生发展过程中所起的重要作用已被许多研究所证实。TGFβ₁ 抑制剂的研究成为肝纤维化治疗中的热点。我们的研究结果显示虫草组TGFβ₁ 及其mRNA 表达较模型组均显著下降。表明虫草菌丝可能在mRNA 水平上抑制TGFβ₁的转录,进而下调其蛋白水平的表达。本研究的另一个重要发现在于证实了虫草菌丝可显著抑制纤维化肝脏PDGF 的表达。众多研究表明PDGF 对HSC 增殖有显著促进作用。一些研究显示PDGF 在几种能够刺激HSC 细胞增殖与DNA 合成的多肽分裂原中是作用最强的一种。尽管PDGF 对HSC 增殖起着不可忽视的作用,但尚无报道探讨研究治疗药物对PDGF 表达的影响。
本研究首次观察了虫草菌丝在mRNA 与蛋白2 个水平上对PDGF 的影响。结果表明虫草菌丝可显著下调PDGF 蛋白水平的表达,而对其mRNA 表达的影响由于统计学数据不支持而暂不明了,但2组间的均数差异(模型组0. 7 ±0. 5 ,虫草组0. 4 ±0. 3) 仍提示虫草菌丝对其mRNA 可能有抑制作用。肝纤维化的发生涉及多重分子细胞学机制。越来越多的证据表明TGFβ₁ 在这一复杂的过程中起着最重要的调节作用。SANDERSON 等人发现单纯过表达TGFβ₁ 的转基因小鼠可发生肝脏及肾脏纤维化。另一些研究表明单纯阻断TGFβ₁ 的作用,即可有效地阻止肝纤维化形成,因而我们推测尽管虫草菌丝对肝纤维化形成的多个病理环节均有抑制作用,但其抑制TGFβ₁ 的作用可能是这一系列作用的始动环节,即下调TGFβ₁mRNA的转录,进而减少TGFβ₁ 蛋白的表达, PDGF 蛋白的表达,抑制活化HSC 的增殖,以及Ⅰ型和Ⅱ型前胶原mRNA 的合成,延缓慢性肝炎向肝硬化的发展,并显著改善肝功能。
[ 参考文献]（略）