慢性阻塞性肺病（COPD）是一种以不能完全可逆的气流受限为特征的疾病，其本质是慢性气道非特异性炎症性疾病，特点是小气道阻力增加和肺动态顺应性下降。吸烟是慢性支气管炎患者COPD 发病的独立危险因素，15.0%的吸烟者最终可发展为COPD。中医认为属“喘症”范畴，肺肾两虚是COPD 的主要发病机制，冬虫夏草作为中药始载于《本草备要》,具有补肺益肾,止咳化痰,可用于肺虚久咳、肾虚喘促、劳嗽咯血等，但其具体作用机制尚不清楚。我们采取大鼠被动吸烟的方法建立COPD 模型，通过人工培育的冬虫夏草喂养COPD 大鼠，并观察动物肺组织形态、咳嗽反射、肺功能及支气管肺泡灌洗液的肿瘤坏死因子（TNF-α ）和白介素- 8（IL-8）等指标，探讨冬虫夏草防治COPD的作用机制。
1 材料和方法
1.1   动物分组与处理雄性Sprague Dawley 大鼠42 只(清洁级)，体重（200±20）g，鼠龄12 周，将SD大鼠随机分：模型组、治疗组、对照组，每组14 只。（1）模型组在自制染毒箱中，每次被动吸烟20 支（上海卷烟厂凤凰牌香烟，焦油量17mg，烟气烟碱量1.4mg），每天3 次，每次持续30min，每次间隔3 小时，共8 周。（2）治疗组在按模型组制备模型的基础上胃饲6ml冬虫夏草菌粉溶液（5g/Kg）（杭州中美制药公司提供）。（3）对照组不吸烟，每天呼吸正常的空气。模型组和对照组每天胃饲等量的无菌蒸馏水。
1.2   肺功能测定、病理标本制作及肺泡计数8 周末从各组中随机取7 只大鼠，用25%乌拉坦（4ml/kg）腹腔注射麻醉，纵行切开颈部，暴露气管，在环状软骨下切一个倒“T”型切口，进行气管插管并固定。用小动物肺功能仪（浙江大学医学院药理教研室制作）和Medlab 医学软件分析系统（南京美易公司）测出并记录大鼠潮气量、气道流速和跨肺压，然后换算成气道阻力和肺顺应性。大鼠测定肺功能后将其股动脉放血处死，取右肺中叶，约1cm×1cm 肺组织连同部分支气管，用10%甲醛固定1 周以上，然后支气管进行爱先蓝- PAS 特殊染色、肺组织进行HE 染色，石蜡制片。肺组织切片在100 倍光镜下观察，将十字交叉的发丝放在显微镜目镜视野的中心位置, 对每张切片连续计数3 个视野内和十字线相交的肺泡数,除以3 后得以平均肺泡计数。
1.3   咳嗽反射测定和BALF 细胞计数及分类每组剩余的7 只大鼠先放入一密闭容器中雾化吸入5%柠檬酸完成咳嗽反射测定，采用Medlab 医学软件分析系统记录10 分钟的咳嗽次数。而后将其股动脉放血处死并行双侧支气管肺泡灌洗，用6mlPBS反复抽吸3 次，以较慢速度回收BALF，总回收率约70%～80%。将200μlBALF 加入200μl 白细胞计数液中，3～5 分钟后摇匀且取1 滴置于血细胞计数板上，在显微镜下计白细胞总数。将余下的BALF 液4℃1500rpm离心15min，收集上清液储存于- 70℃的冰箱内，待测细胞因子。离心后取沉淀物涂片，制作3 张涂片，用Wright- Giemsa 法进行染色计数，每个标本计数200 个有核细胞，并进行细胞分类。
1.4   BALF  细胞因子的测定采用双抗体夹心ABC- ELISA 法测定TNF-α 、IL-8 （Biosource 公司进口，上海森雄公司分装提供），按试剂盒操作说明书进行测定。
1.5   统计分析所有数据均以x±s表示，采用t 检验判断均数差异显著性，全部资料采用SPSS11.0 软件操作。
2 结果
2.1   肺组织切片结果模型组肺组织具有慢性支气管炎阻塞性肺气肿特征性的病理形态学改变，支气管上皮细胞坏死脱落，柱状纤毛倒伏、粘连，支气管壁杯状细胞增生，部分肺泡壁破坏、融合，肺泡孔扩大，细支气管壁及周围组织有大量淋巴细胞及少量中性粒细胞、浆细胞浸润，管腔内有分泌物潴留;治疗组上述病理改变较模型组明显减轻; 对照组大鼠的肺泡结构正常,病理改变见图1～3。与对照组相比,模型组、治疗组的平均肺泡计数明显减少,但治疗组高于模型组，见表2。
2.2   支气管肺泡灌洗液中白细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数及TNF-α  和IL-8 测定结果模型组与对照组相比，BALF 中白细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞绝对数及TNF-α  和IL-8 水平显著升高；而治疗组与模型组相比，BALF 中白细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数及TNF-α  和IL-8 水平明显下降，但仍高于对照组。见表1。
2.3   咳嗽反射、肺功能的测定与对照组相比，模型组的大鼠咳嗽次数明显增多，且气道阻力增加明显，肺顺应性显著下降；而与模型组相比，治疗组的大鼠咳嗽次数明显减少，气道阻力明显下降，而肺顺应性上升。见表2。

3 讨论
      目前对COPD 发病机制尚不完全清楚，多数认为其发生发展与肺部对有害颗粒和气体所产生的异常炎症反应有关，吸烟是发生COPD 的独立危险因素，本实验采用给大鼠反复被动吸烟的方法建立的COPD 模型符合人类COPD 发生发展的自然过程，本模型的肺组织形态和肺功能均符合气流受限的慢性支气管炎阻塞性肺气肿特征。
      冬虫夏草始载于清，其具有补肺益肾，止咳化痰之效，用于久咳虚喘、劳嗽痰血等。近年有人研究发现冬虫夏草主要活性成份是D- 甘露醇,还包括多种人体必需氨基酸、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、麦角甾醇及微量元素等,其具有增强机体免疫力、抗炎、抗氧化及止咳化痰和舒张支气管平滑肌等作用[3]。本研究发现，与对照组比较，治疗组气道阻力升高，平均肺泡计数减少,肺顺应性下降，咳嗽次数和BALF 的炎症细胞数、TNF-α 、IL-8 上升，但与模型组比较均有改善，说明冬虫夏草虽然不能阻止模型组COPD的形成，但能有效抑制炎性细胞在气道腔中募集和激活，从而减轻气道炎症，导致气道壁的血管通透性下降、黏膜充血水肿减轻及分泌物减少，抑制了气道重构和气道阻塞的发生发展，延缓肺功能减退，这对COPD 的防治有积极作用。
      吸烟是COPD 的主要发病原因，大多数文献报道15.0%吸烟者将发展为COPD，但也有文献报道单纯吸烟人群COPD 的发病率可高达24.6%，而吸烟合并慢性支气管炎者COPD 发生率甚至高达40.0%，并且随着吸烟指数的增加该比例亦呈上升趋势。本研究还发现模型组咳嗽次数增多，气道阻力增加，肺顺应性下降, 平均肺泡计数减少,BALF的中性粒细胞、巨噬细胞绝对数及TNF-α 、IL-8 明显升高,其中中性粒细胞数增加最为显著，平均中性粒细胞数是对照组的16 倍。人们发现香烟中含有尼古丁、烟焦油、一氧化碳等多种有害物质，一方面，这些有害物质可激活肺部巨噬细胞、中性粒细胞及T 淋巴细胞，这些炎性细胞释放前炎因子TNF-α ，其可刺激上皮细胞IL-8mRNA 和蛋白表达增加，而IL-8 又是中性粒细胞的重要趋化因子，进一步促使中性粒细胞由血液循环向气道炎症部位募集和激活，中性粒细胞释放白三烯，通过呼吸爆发产生大量的氧自由基，破坏了肺泡的结构,引起气管、肺实质、肺血管慢性炎症,导致肺顺应性下降，气道阻力增加；另一方面，吸烟能使支气管上皮纤毛变短，引起不规则纤毛运动障碍，削弱支气管纤毛清除细菌功能，从而使细菌定植，产生大量毒素，引起支气管痉挛、气道阻力增加。吸烟还可刺激气管杯状细胞的增生和气道感觉神经末梢，导致黏液过多分泌，这些亦可导致肺顺应性下降，气道阻力增加，促进肺气肿的发生。我们先前的研究还发现吸烟可使以T 淋巴细胞为主的细胞免疫功能减弱，特别是Th1 免疫功能减弱, 导致Th1/Th2 失衡，冬虫夏草正是通过提高Th1 的免疫应答，纠正COPD 大鼠的Th1/Th2 失衡, 从而抑制肺功能恶化, 延缓COPD 的进展。
     本研究提示冬虫夏草对慢性阻塞性肺病大鼠模型的气道炎症有抑制作用，并能改善肺功能，为临床治疗提供理论依据。
４ 参考文献（略）