摘要 目的:观察冬虫夏草提取液对体外培养的人结肠癌细胞株HT-9、SW480的抑制效应,并利用报告基因技术初步探明其发挥抑制作用的机制。方法:体外培养两种结肠癌细胞株,加入冬虫夏草提取液干扰,使用MTT法检测对肿瘤细胞增殖的抑制作用。利用报告基因技术,检测转染荧光素酶报告基因后的SW480细胞内NF-κB相对活性,观察冬虫夏草提取液对细胞NF-κB活性的影响。分离细胞胞质蛋白,使用免疫蛋白印迹技术检测各组细胞内NF2κB抑制蛋白( I κBα)的含量,观察虫草提取液对IκBα的影响。结果:冬虫夏草提取液可以有效的抑制两种结肠癌细胞的增殖,并具有良好的剂量2效应关系。报告基因检测结果表明TNF2α可明显增强NF2κB活性( P <0.05) ,而冬虫夏草提取液可抑制这种激活作用( P < 0.05) ;免疫蛋白印迹实验表明,虫草提取液可有效抑制细胞内I κBα的降解。结论:冬虫草提取液可以抑制I κBα的降解,从而抑制NF-κB活性并通过这种作用抑制结肠癌细胞增殖。
关键词 冬虫夏草;结肠癌;报告基因;核因子κB
中图分类号: R28515 文献标识码:A 文章编号: 100124454 (2007) 0320310204
Inhibitory Effects of Cordyceps Extract on Growth of Colon Cancer Cells
HUANG Hao1, WANG Hang2, LUO Rong-cheng(1. Cancer Center, Nanfang Hosp ital, SouthernMedicalUniversity, Guangzhou 510515, China; 2. Second Department of Geratology, Wuhan General Hosp ital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China)
Abstract Objective: To observe the inhibiting effect of Cordyceps extract on the growth of colon cancer cell lines in vitro and its mechanism.Methods: MTT assay was used to evaluate the inhibiting effect of Cordycep s extract on the p roliferation of colon cancer cells1 Report Gene was used to evaluate the relative NF-κB activity of the SW480 cellswhich were transfectd by pNF-κB.TA-Luc report gene.Western blot analysiswas used to evaluate the content of I κBα in SW480 cells1.Results: Cordycep s extract could inhibit the proliferation of HT-29 and SW480 cells in a dose-dependentmanner. Report gene showed that TNF-α enhance the activation ofNF-κB in SW480 cells and Cordyceps extract Could decrease the activation of NF-κB induced by TNF-α in SW480 cells.Western blot analysis showed that TNF-α can induce the degradation of IκBα of SW480 cells and Cordyceps extract can inhibit it1.Conclusion: Cordyceps extract can inhibit the p roliferation of colon cancer cells through inhibiting the degradation of IκBα in the cell and inhibiting the activation of NF-κB.
Key words Cordyceps; Colon cancer; Report gene; Nuclear factor κB
冬虫夏草系麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis (BerK) Sae寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,具有补肺益肾、止血化痰功效,是我国特有的名贵珍稀药材。其抗肿瘤活性已被许多体内外的实验研究所证实,但作用机理尚不清楚。我们的既往研究也表明冬虫夏草提取液对于体外培养的肝癌细胞HepG-2细胞的增殖具有明显的抑制作用。本研究证实冬虫夏草提取液对体外培养的人结肠癌细胞也有明显的抑制作用,并进一步采用报告基因及免疫印迹法证实该抑制作用可能是通过抑制结肠癌细胞的NF-κB结合活性达成的。
1 材料
1.1 材料 人结肠癌细胞株HT-9、SW480 引自ATCC,购于武汉大学典型组织保藏中心。阿司匹林(西南药业股份有限公司) ,二甲亚砜、MTT粉剂购自Sigma公司, pNF-κB-TA-Luc和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β-gal、RPMI-1640、胎牛血清( FBS)购自美国Clontech, 脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Gibco公司, TNF-α、NF-κB抑制蛋白( IκBα)多抗,购自美国Santa公司,β-actin单抗、辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗兔为购自美国Jackson公司。天然冬虫夏草购于南方医院中药房。虫草提取液的制备:天然虫草粉碎后,常温下70%乙醇提取24 h,蒸干乙醇,滤液减压浓缩至3 g/ml,高效液相色谱法测定浓缩液中腺苷浓度,浓度为1375.7μg/g,超过《中国药典》中对于虫草的质量控制标准。临用前RPM I-1640配制成相应浓度,NaOH调节pH值为7.2-7.4。
1.2 仪器 蛋白电泳仪,瑞典Amershom Phamacia Biotech公司; HTS 700 Bio Assay Reader,美国Perkin Elmer公司;半干式电转膜仪,法国Viber lourmat公司。
2 方法
2.1 MTT实验 人结肠癌细胞株HT-29、SW480细胞常规培养于含5% FBS的RPM I-1640 培养液中。取对数生长期的细胞,按4.0 ×104 /ml接种于96孔板,每孔接种200μl,继续培养24 h后,用无血清的RP-I21640培养液培养24 h,分为7组,每组12孔。阳性对照为阿司匹林组,药物终浓度为1×10-2 mol/L;冬虫夏草提取液组共5组,药物终浓度分别为1∶10, 1∶20, 1∶40, 1∶80, 1∶160;空白对照组加入等量RPMI-1640培养液,继续培养20 h。每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT 20μl,继续培养4 h,弃上清,加入150μl二甲亚砜,混合均匀,在HTS 7000Bio Assay Reader上选取490 nm波长测定每孔吸光度值(A值) 。
2.2 NF-κB相对活性测定 采用报告基因技术。
2.2.1 细胞的准备:选取SW480细胞,含5% FBS的RPM I21640培养液中常规培养,于转染前一天将1 ×105个细胞均匀铺入24 孔培养板中,共分为8组,每组3孔,重复实验3次。
2.2.2 瞬时共转染实验: 24孔培养板传代培养细胞融合度约50%时,依照Lipofectamine转染试剂的操作指南,在EP管中分别加入50μl Opti-MEM,将待转染质粒(每孔共0.5μg) ,分别加入EP管中,混匀,加入Lipofectamine转染试剂,混匀,室温静置10min。吸去细胞培养基, PBS冲洗1-2 遍,每孔加入培养液0.5 ml (含血清和抗生素) 。加入转染混合物,轻轻摇匀,阿司匹林组和海龙1-5组于转染4 h后加入相应浓度药物,继续培养20 h,其后空白对照、阿司匹林、海龙各组均加入TNF-α至终浓度为1nmol/L, 1 h后收取细胞。未处理组继续培养,各组同时收集细胞,准备测定。
2.2.3 NF2κB荧光素酶(NF-κB-Luc)及β2半乳糖苷酶(β-gal)活性测定:彻底吸去细胞原培养基,用1×PBS缓冲液将共转染细胞轻轻冲洗122遍。每孔加入100μl 1 ×ReporterLysisBuffer (RLB) ,轻轻晃动培养板,冰上孵育15 min,小心刮下所有的裂解细胞,用移液器将裂解物迅速移入预冷的115 ml微量离心管中。离心2 min ( 4℃, 12 000 rpm) ,保留上清, - 70℃冻存备用。
荧光素酶活性按如下方法检测:取细胞裂解上清50μl加入96-well black polystyrene Glass Bottom Microp lates(黑色聚苯乙烯防止荧光散射对周围孔的影响,玻璃底有利于荧光的完全透过) ,分别加入50 μl Steady-Glo regent (使用前将Steady-Glo Buffer与Steady-Glo Substrate 充分混匀至Steady-Glo Substrate完全溶解)于96孔板中,冰上孵育5min。在激发波长430 nm,发射波长550 nm 设置下,使用HTS 7000 Bio Assay Reader检测荧光素酶活性。
β-gal活性检测方法如下:取细胞裂解上清50μl加入96-well black polystyrene GlassBottom Microplates,分别加入50 μl 2 ×β2gal Assay Buffer并混匀, 37℃孵箱中孵育,当溶液由无色变为浅黄色时,加入150 μl碳酸钠(Na2 CO3, 1 mol/L )中止反应。在吸收波长为405 nm处,使用HTS 7000 Bio AssayReader检测β-gal值。
各组细胞NF-κB相对活性=荧光素酶强度值/β-gal值,即相对发光值( relative light unit, RLU) 。
2.2.4 NF-κB 抑制蛋白( κBα) 表达检测: 采用Western印迹法。选取SW480细胞, 10 cm培养皿培养,分为三组,治疗组给予冬虫夏草提取液( 1 ∶10)处理24 h,对照组给予终浓度为1 nmol/L TNF-α刺激1 h,空白组常规培养。分组处理完毕后,参照文献方法,各组取约107 细胞, PBS冲洗后收集;重悬,冰浴15 min,加入25μl NP240,振荡10s; 14000g离心15 min,收集上清即为胞质蛋白。用BAC蛋白质检测试剂盒测定并调节蛋白浓度, 270℃冰箱保存备用。用12% SDS-PAGE 电泳( 90V, 50 min;110V, 2 h) ,半干式电转移( 1 mA / cm2 , 1 h) ,结束后,将PVD膜洗涤三次,室温封闭4 h (含5%脱脂奶粉, 0101% Tween) ;加入抗I κBα多抗( 1 ∶200) ,抗β-actin单抗(1∶1000) , 4℃冰箱,过夜;洗涤后加入二抗(1∶4000) , 37℃, 2 h; KODAK图像工作站曝光5 min,并摄像,凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带灰度。
2.3 统计学处理 SPSS 1010 软件作数据统计。组间比较采用t检验。
3 结果
3.1 冬虫夏草提取液对两种结肠癌细胞增殖的抑制作用 MTT结果显示: 在作用浓度为1 ∶160 ～1∶10范围内,冬虫夏草提取液对两种结肠癌细胞株增殖均有抑制作用,以终浓度为1∶10抑制作用最显著,而当作用浓度为1∶160时,抑制作用较弱,同空白对照组相比没有统计学差异。而在我们实验的浓度范围内,冬虫夏草提取液抑制细胞增殖的能力与冬虫夏草提取液干预浓度密切相关,药物浓度越大,抑制作用越强。见表1。
3.2 冬虫夏草提取液预处理的细胞NF-κB相对活性明显降低 报告基因检测结果表明:相对于未处理组,空白对照组加入TNF-α刺激后,其细胞内NF-κB相对活性明显升高( P < 0.01) ;而加入药物干预后的各组,其NF-κB 相对活性均有不同程度降低,虫草1、2、3、4组均低于未处理组( P < 0.05) ,亦低于空白对照组( P < 0.01) ;而虫草5组稍低于空白对照组,两者差异无统计学意义。见图1。
3.3 冬虫夏草提取液处理的细胞NF-κB抑制蛋白( I κBα)含量检测 见图2。
蛋白印迹实验结果表明:经TNF-α刺激后,细胞内NF2κB抑制蛋白( κBα)含量明显降低,而经冬虫夏草提取液处理后的细胞, I κBα含量明显高于刺激组和对照组。
4 讨论
核因子κB ( nuclear factor-KappaB, NF-κB ) 是1986年在B淋巴细胞中首先发现的一种核因子,后来发现NF-κB 存在于几乎所有类型的哺乳动物细胞中。是普遍存在于细胞浆中以p50 /p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子,与NF-κB的抑制性蛋白( inhibitor kappa B, IκB )结合而呈非活性状态。大量研究表明, 它可以被多种刺激剂, 如TNF-α、IL-1、神经生长因子、蛋白激酶C激活剂、有丝分裂原、氧化剂、细菌、病毒、免疫刺激剂、脂多糖、自由基以及紫外线等激活,从而调节许多靶基因的表达, 因此被誉为控制早期基因表达的基因开关。NF-κB 不仅参与感染、炎症、应激、免疫反应、细胞凋亡,肿瘤等病理过程,还参与细胞周期与细胞分化的控制等, NF-κB 的活化有利于细胞的生存并促进细胞增殖。
研究表明,当TNF-α与细胞膜受体结合后,可以形成两种不同的复合物,分别导致细胞存活和促进细胞凋亡。一种复合物可通过对细胞内NF-κB的激活而促进细胞存活,另一种复合物可通过Caspases生成而促进细胞的凋亡。在实验二中,我们选择转染成功率较高的SW480细胞,使用报告基因技术将耦联了荧光素酶报告基因的NF-κB 质粒转染细胞,并使用同时转染的β-gal作为内参照,这样可以比较直观的反应细胞内的NF-κB 的活性。结果表明,经过TNF I-α刺激后的细胞其NF-κB 相对活性明显增加,而经过阿司匹林和虫草提取液处理后的细胞,其细胞内NF-κB活性为存在不同程度的下降,而且当药物浓度大于1∶160时,各组细胞的NF-κB活性均低于未经处理组,这些也同我们之前的MTT实验结果相符,表明虫草提取液的抑制作用可能是通过抑制NF-κB的活性来达成的。
细胞未受到刺激时, NF-κB 与它的抑制性亚基I-κB结合在一起,不具有活性。当各种刺激因素通过IκB 激酶复合体( Inhibition2Kappa B kinaese,IKK)磷酸化和活化。激活的IKK复合体特异性使I κBαs磷酸化, I κB s迅速泛素化,成为蛋白酶体降解的靶目标。随着抑制剂解离, NF-κB 从胞浆移位至细胞核,与靶基因启动子/增强子上的κB 位点结合,刺激转录过程。在实验三中, 我们分离了SW480细胞的胞质蛋白,并用Western印迹法检测了各组细胞内IκBα的含量,结果也证实冬虫夏草提取液处理的细胞,其胞质内IκBα含量明显高于TNF-α刺激组和对照组。这样,我们就证实了冬虫夏草提取液抑制结肠癌细胞增殖的作用是通过抑制I κB的降解,从而影响了细胞内NF-κB的活性,造成细胞增殖困难。
总之,在本研究中,我们已经证实,冬虫夏草提取液可以抑制IκBα的降解,从而抑制NF-κB 活性并抑制肿瘤细胞增殖。但是中药的效应往往是多方面、多靶点综合作用的结果,冬虫夏草提取液是否尚存在其他的影响肿瘤细胞生存的方式,尚有待我们的进一步研究,而冬虫夏草提取液是如何抑制I κBs降解的也有待进一步的研究。
参考文献（略）
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