【摘要】 目的　观察冬虫夏草[cordyceps sinensis(berk) sace ,CS]对H22肝癌小鼠化疗后NK细胞活性、淋巴细胞增殖、IL-2 水平的影响。方法　将接种H₂₂细胞24 h 的带瘤小鼠随机分为4 组,每组10 只:空白对照组(等体积生理盐水,灌胃) ,CS 组(CS 210 g/ kg ,灌胃) ,Cy 组(Cy 20 mg/ kg ,腹腔注射) ,CS + Cy 组(CS 210 g/kg ,灌胃+ Cy 20 mg/ kg ,腹腔注射) ,每天1 次,连续给药7 d ,给药结束后处死小鼠观察经治疗后H22带瘤小鼠的上述指标的变化。结果　CS 组和CS + Cy 组带瘤小鼠的NK细胞活性及IL-2 水平明显增强,淋巴细胞转化指数明显增高,与对照组及单用Cy 组相比差异有显著意义( P < 0105 或P < 0101 ,或P < 01001) 。结论　CS 可对抗或恢复肿瘤对化疗药导致的免疫抑制或免疫缺损,该结果对临床应用中药与化疗药物进行肿瘤治疗具有十分重要的指导意义。
     【关键词】　冬虫夏草　H₂₂肝癌　免疫功能
The influence of cordyceps sinensis sace on the immunologic function of the rats with liver cancer ( H₂₂) after chemotherapy 　SUN Yan , GUA N Ji , WANG Qi . Dept . of Etiology and Immunology , Qiqihar Medical College ,Heilongjiang ,161042
    【Abstract】　Objective 　To observe the activity of the NKcell ,proliferation of the lymphocytes and IL22 levelof the rats with liver cancer ( H₂₂) after chemotherapy ,in order to understand the effect of the cordyceps sinesis(berk) sace (CS) . Methods 　The rats with tumors vaccinated with H₂₂ cell 24h were divided into 4 groups randomly ,10 rats each group :the blank control group (filling their stomachs with isovolumetric normal saline) ,the CS group(filling their stomachs with CS 2. 0g/ kg) ,the Cy group (intraperitoneal injection with Cy 20mg/ kg) ,the CS + Cygroup (filling their stomachs with CS 2. 0g/ kg and intraperitoneal injection) . They were given the medicines once aday for 7 days. After that ,kill them to observe the changes of the above index of the rats with tumors after therapy.Results 　The CS group and the CS + Cy group showed that the activity of NK and IL22 level evidently enhanced ,and that the transfor mation index of the lymphocyte obviously increased. There was great difference between theabove two groups and the blank control group and the Cy group ( P < 0. 05 or P < 0. 01 ,or P < 0. 001) . Conclusion 　CS can prevent or restore the immunologic function or the immunologic defect from chemotherapy which is vital toapply traditional Chinese medicine and themotherapy medicine to treat the tumors.
      【Key words】　Cordyceps sinensis(berk) sace (CS) 　Liver cancer (H22 　Immunologic function
      冬虫夏草(cordyceps sinensis (berk) sace ,CS) 是我国传统的名贵滋补强壮药。清朝赵学敏《本草纲目拾遗》载“冬虫夏草味甘、性温”;主要作用有“保肺气”“, 益肾,补精髓”。现代医学研究表明CS 具有免疫保护、抑瘤、促进造血、抗炎抑菌及抗心律失常等多种药理作用。但有关冬虫夏草对化疗后免疫功能的影响未见报道。本实验用冬虫夏草的水提取物观察对H₂₂肝癌小鼠化疗后免疫功能影响的结果,旨在为其有关的应用提供实验和理论依据。
1 　材料与方法
1.1 　药品与试剂　冬虫夏草，按文献制备水煎剂,每100 ml 溶液中含100 g 生药,体外实验时需将制剂经浓缩灭菌处理,四氮甲唑蓝(MTT) 、刀豆蛋白A(ConA) 、RPML21640 完全培养基、环磷酰胺(Cy)为市售产品。
1.2 　动物与细胞株　C57BL/ 6 小鼠,4～6 周龄,雄性。H22肝癌细胞株,K562细胞株为人红白血病细胞株。
1.3 　试验方法
1.3.1 　H₂₂动物移植瘤的接种　取传代6～7 d 的H22带瘤小鼠,无菌抽取乳白色腹水。2 g/ L 台盼蓝染色,镜下检查活细胞> 96 %。以生理盐水稀释瘤液至细胞浓度5 ×105/ ml ,每只小鼠腹腔接种012 ml ,建立实验模型。
1.3.2 　动物分组　H22带瘤小鼠随机分为4 组,每组10 只,空白对照组(等体积生理盐水,灌胃) ,CS 组(CS 210 g/ kg ,灌胃) ,Cy 组(Cy 20 mg/ kg ,腹腔注射) ,CS + Cy 组(CS 210 g/ kg ,灌胃+ Cy 20 mg/ kg ,腹腔注射) ,每天1 次,连续7 d。
1.3.3 　NK细胞活性观察　参照文献 的方法略有改动。于停药后第1 天处死小鼠,无菌摘除脾脏,制备脾细胞悬液,调脾细胞浓度为4 ×106/ ml ,加入96 孔培养板,每孔100μl ,每只小鼠脾细胞设3 个重复孔。取对数生长期K562细胞,调细胞浓度为2 ×105/ ml ,每孔加入100μl ,使每孔效靶比为20∶1 。平行设效应细胞对照孔。按MTT 方法加入试剂及测D值,依下式计算杀伤率:

      注:DE+ T :效应细胞D 值+ 靶细胞D 值;DE :效应细胞D 值;DT相应靶细胞对照孔D 值
1.3.4 　小鼠T 淋巴细胞增殖实验　无菌取小鼠脾脏,挤压过100 目不锈钢筛网,用含10 %胎牛血清的RPMI1640 培养液调至细胞浓度至5 ×106/ ml 。在96 孔细胞培养板中,加入脾细胞悬液200μl/ 孔,加入ConA 10μl/ 孔(终浓度5 mg/ ml) ,每个样品做3 个复孔。在37 ℃、5 %CO₂培养箱中孵育48 h 后,每孔弃去100 μl ,加入10 μl (5 mg/ ml)MTT 溶液再孵育4 h ,取出每孔加入10 %盐酸SDS 溶液100μl ,再孵育8 h 后,在酶标仪上测OD 值(测定波长570 nm ,参考波长630 nm) 。
1.3.5 　IL-2 活性测定　参照文献[ 6 ]于停药后第1 天处死小鼠,无菌取出脾脏,挤压过100 目不锈钢筛网,加入适量的NH₄Cl (0.83 %) 缓冲溶液溶解红细胞, RPML-1640 洗涤2次,台盼蓝染色调细胞浓度8 ×106/ ml ,在24 孔培养板中,加入脾细胞悬液110 ml ,再加入10μg/ ml ConA 1.0 ml ,37 ℃、5 %CO2 培养24 h ,收集上清,即IL-2 待测样品,用IL-2 依赖株(cytotoxic TLymphocyte line ,CTLL) 细胞作为检测细胞,调整细胞浓度至110 ×106/ ml ,接种于96 孔培养板,每孔100μl ,再加入100 ml 待测IL-2 样品,37 ℃,5 %CO2 培养24h ,用MTT 比色法测各孔A570nm。
2 　结果
2.1 　CS 对H₂₂肝癌小鼠化疗后NK活性的影响　H₂₂肝癌小鼠化疗后NK活性明显下降,给予CS 后可拮抗化疗H₂₂肝癌小鼠NK活性的降低(见表1 , * P < 0.05 , # P < 0.01 ,△与对照组比较) 。

2.2 　CS 对H₂₂肝癌小鼠化疗后T 淋巴细胞增殖的影响　CS 能显著提高化疗H₂₂肝癌小鼠脾细胞对T 细胞丝裂原ConA 诱导的转化能力(见表2 , △与对照组比较; # P <0.01) 。

2.3 　CS 对化疗H₂₂肝癌小鼠IL-2 活性的影响　CS 能明显促进化疗H22肝癌小鼠脾细胞产生IL-2 的能力,与Cy 组比较,差异有显著意义(见表3 , △与对照组比较; # P < 0.01) 。

3 　讨论
      免疫功能缺陷或低下易诱发肿瘤。放疗和化疗除直接杀伤肿瘤细胞外,对宿主的免疫系统也造成损害,由此抗肿瘤药物的药理研究已从化疗治疗发展到免疫治疗。近年来临床上已开始采用免疫辅助疗法用于肿瘤治疗中,尤其是中药的应用对于提高机体免疫力维持机体免疫功能的相对稳定,改善恶变、化疗及放疗所引起免疫功能低下均有一定疗效,其独到之处是现代医学所不及的。冬虫夏草作为滋补强身的名贵中药,除具有补益肺肾,止血化痰等作用,本实验证明冬虫夏草还作为生物反应调节剂(BRM) ,与Cy联合应用后,亦能明显减轻Cy 对H₂₂肝癌小鼠免疫系统功能的损伤作用,使带瘤小鼠的免疫功能有所增强或恢复至对照水平,从而提示采用冬虫夏草与化疗药物联合应用,可恢复化疗免疫抑制的副作用,并协同化疗药物杀伤肿瘤细胞,对今后的临床应用具有十分重要的指导意义。
参考文献（略）