摘要: 采用牛血清白蛋白免疫损伤大鼠肝纤维化模型,以虫草菌丝和秋水仙碱为对照,通过肝组织病理学与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGFβ1 、TGFβR1 、Dm 阳性细胞免疫组化观察,肝Hyp 含量与肝胶原酶活性检测,观察虫草多糖抗肝纤维化的作用与机制。结果显示,虫草多糖与虫草菌丝及秋水仙碱均能减轻肝纤维化程度,降低Hyp 含量,减少胶原及TGFβ1 生成与分泌,降低TGFβR1 表达,减少Dm阳性细胞,其中虫草多糖对Ⅳ型胶原与TGFβR1 表达的影响更为明显。提示虫草多糖具有良好的抗肝纤维化作用,可能是虫草菌丝抗肝纤维化的主要有效成分之一,其作用机制可能在于抑制肝星状细胞的活化及其TGFβ1 的表达。
关键词: 虫草多糖;虫草菌丝;秋水仙碱;肝纤维化;免疫损伤;实验研究
中图分类号: R 28515 文献标识号: A 文章编号: 100721334 (2000) 0920037204
有研究表明, 虫草菌丝有抗肝纤维化的作用 ,但其何种成分在起作用尚未明确。本实验通过免疫损伤大鼠肝纤维化模型,重点研究虫草菌丝有效成分———虫草多糖的抗肝纤维化作用及其机理,现报告如下。
材料与方法
一、材料
1. 实验动物 Wistar 大鼠70 只,体重100～140g ,SPF 级,中科院上海实验动物中心提供。
2. 药物 虫草多糖,用乙醇分级提取法自虫草菌丝中提取,得率1.25 %;虫草菌丝溶液,水煎浓缩而成,浓度为2mg/ ml ;秋水仙碱,Serva 公司产品。
3. 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA) ,Boehringer公司产品;弗氏不完全佐剂,羊毛脂100g 加入液体石蜡200ml ,65 ℃熔化混匀制成,高压消毒,4 ℃储存;兔抗人TGFβ1 与兔抗人TGFβR1 为Santa Cruz 公司产品;兔抗鸡Dm、兔抗牛Col Ⅰ、兔抗人Col Ⅲ、兔抗人Col Ⅳ、羊抗兔IgG、兔PAP 复合物均购自上海医科大学病理教研室;正常人胎盘,由国际和平妇幼保健院提供;羟脯氨酸(Hyp) 标准品,为Nacalai Tesque 公司产品。
二、方法
1. 造模 取8 只大鼠为正常对照组,余鼠造模 ,先用18mg/mlBSA 生理盐水溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化液作皮下多点致敏注射,每次0.5ml/ 只,共5 次。第1、2 次间隔2W,余间隔1W。末次注射后1W开始尾静脉攻击注射,每W2 次,共12 次。每鼠自2.0mg•0.4/mlBSA 生理盐水溶液开始,每次递增0.1mg ,第12 次为3.4mg•0.4/ml 。正常组以同样方法注射生理盐水。
2. 分组与用药 于第8 次攻击注射后,按体重随机分为模型对照组(14 只) 、虫草多糖低剂量组(简称虫糖低剂组,12 只) 、虫草多糖中剂量组(简称虫糖中剂组,12 只) 、虫草菌丝组(12 只) 、秋水仙碱组(12 只) 。自次日开始,正常对照组与上述各组按100ml/(Kg•d)剂量,依次分别灌以蒸馏水、蒸馏水、0.2 %虫草多糖、0.6 %虫草多糖、16 %虫草菌丝溶液、1mg %秋水仙碱。全部动物除造模过程中死亡4只外,均于末次注射后第22 天处死取材。用药共34天。
3. 肝组织病理观察 (1) HE 染色,光镜观察。(2) 胶原纤维,改良Mallory 法染色,光镜下半定量分级,并用MPIAS2500 作图像分析,结果以平均每个视野中胶原所占面积的百分比表示。
4. 免疫组织化学观察 采用PAP 法,观察包括: (1) 转化生长因子β1 (TGFβ1 ) 、转化生长因子β受体1 (TGFβR1 ) 变化,光镜观察,以正常胎盘组织为阳性对照。(2) 血窦中结蛋白(Dm) 阳性细胞计数,每张切片数10 个高倍视野,求平均每视野阳性数。(3) Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原图像分析,以平均每视野中胶原占面积的百分数表达。 TGFβR1 表达强度分级:强于正常组,TGFβR1 呈膜浆型分布, ( +++ ) ;稍强于正常组,TGFβR1 膜上阳性染色区域增宽或伴颗粒状增强( ++ ) ; 正常组,TGFβR1 呈膜型分布,线性增强( + ) ; 弱于正常组,TGFβR1 膜上无明显线性增强( - ) 。上述程度分别记予3、2、1 和0 分。
5. 肝组织Hyp 测定 采用Jamall 方法;胶原酶活性测定 按本所常规方法进行。
6. 统计方法 方差,q 检验,Ridit 检验, t 检验。
结 果
一、虫草多糖对肝组织病理改变的影响
1. 光镜组织学 模型对照组纤维结缔组织大量增生,多数形成较宽的纤维间隔;汇管区和纤维间隔见较多炎症细胞浸润;少数肝细胞点状坏死,甚至呈灶状坏死。各用药组多数大鼠纤维组织增生、炎症细胞浸润和肝细胞坏死较模型组轻,但各用药组之间的差异不明显。
2. 胶原纤维 模型对照组汇管区胶原显著增生,伸入并分割肝小叶形成假小叶,其中1/ 3 接近小圆形。各用药组多数大鼠汇管区胶原纤维减少,纤维间隔较窄。Ridit 检验提示胶原纤维增生程度有减轻趋势(见表1) 。
图像分析结果,模型对照组胶原纤维面积为17.8 ±4.4 %; 虫糖低剂组、虫糖中剂组、虫草菌丝组、秋水仙碱组分别为13.3 ±1.0 %、10.1 ±3.0 %、11.4 ±3.0 %、9.8 ±1.0 % ,均显著低于模型对照组( p < 0.01) 。
二、虫草多糖对免疫组织化学的影响
1. 对TGFβ1 的影响 正常大鼠未见TGFβ1 表达。模型对照组TGFβ1 阳性染色见于纤维间隔中的炎症细胞周围,其中少数胞浆中呈阳性。各用药组TGFβ1 阳性染色强度较模型组有所减轻,纤维间隔中炎症细胞、间质细胞胞浆内阳性染色明显减弱,这些细胞周围的阳性染色亦有不同程度的减轻。
2. 对TGFβR1 表达的影响 模型对照组在肝间质细胞、炎症细胞、卵圆细胞TGFβR1 表达增强,多呈膜浆型分布。各用药组TGFβR1 表达均有减弱。如以阳性强度高于正常鼠的为异常,则经四格表直接概率法检验(单侧) 示低剂量和中剂量虫草多糖可明显降低TGFβR1 的表达(见表2) 。
3. 血窦Dm 阳性细胞变化 正常对照组Dm阳性细胞数为6.65 ±0.79 ;模型对照组显著增多,为20.1 ±4.6 ( p < 0.01) ,多数胞浆呈典型的星状或多突起状染色;虫糖低剂组、虫糖中剂组、虫草菌丝组、秋水仙碱组Dm 阳性细胞分别为11.9 ±1.7、10.7 ±3.8、8.3 ±2.1、8.3 ±2.2 ,均较模型对照组明显减少( p < 0.01) ,部分阳性染色的胞浆突起不典型。
4. 胶原增生情况 模型组Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原大量增生,形成较宽的纤维间隔,多数伸入并分割肝小叶形成假小叶,血窦中可见Ⅰ、Ⅳ型胶原的弱阳性染色。各用药组多数Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原沉积减轻,纤维间隔窄,而各用药组之间无显著差异。各用药组血窦中Ⅰ、Ⅳ型胶原阳性染色亦有所减轻,以中剂量虫草多糖作用明显。虫糖中剂组和秋水仙碱组的Ⅰ型胶原、虫糖低剂组和虫糖中剂组的Ⅲ型胶原、各用药组的Ⅳ型胶原均显著小于模型组(见表3) 。
三、虫草多糖对肝组织Hyp 含量的影响 各用药组肝组织Hyp 含量均较模型组显著降低,而各用药组之间无显著性差异(见表4) 。
四、虫草多糖对肝组织胶原酶活性的影响 低、中剂量虫草多糖及虫草菌丝虽然有增强胶原酶活性的趋势,但无显著差异(见表4) 。
讨 论
肝纤维化以肝脏细胞外基质的大量增生沉积为特征,是各种原因引起的慢性肝病的共同病理特点。肝细胞损伤是肝纤维化发生的重要因素。本实验通过异种蛋白免疫损伤大鼠,结果大鼠肝脏羟脯氨酸(Hyp) 明显增高,胶原纤维沉积并形成间隔和假小叶,证实免疫异常在肝纤维化病理过程中起重要的作用。虫草菌丝具有抗肝损伤与肝纤维化的作用,虫草多糖为其中的多糖成分,研究报道其有纠正免疫异常与增强非特异性免疫的作用,并可促进乙型肝炎病毒e 抗原的阴转 。本实验将虫草菌丝与虫草多糖治疗免疫损伤肝纤维化模型大鼠,结果两药均显著减轻肝脏纤维沉积,降低肝组织Hyp 及胶原含量,并与公认具有较好效果的抗肝纤维化药物秋水仙碱疗效相似,表明虫草多糖可能是虫草菌丝抗肝纤维化的主要有效成分之一,临床上可采用虫草多糖部分代替虫草菌丝,以利于提高制剂质量。
肝星状细胞活化是肝纤维化形成的细胞学基础,而TGFβ1 通过Smad 等细胞信号转导途径调控星状细胞的活化,是调节肝脏细胞外基质生成与降解代谢的重要细胞因子,在肝纤维化病理中起关键作用 。TGFβR1 广泛分布于多种细胞,而TGFβ1 是通过结合TGFβR1 表现出作用,TGFβR1 表达的增强验模型大鼠肝组织TGFβ1 及其受体TGFβR1 表达较正常大鼠显著增强,说明TGFβ1 介导的肝脏细胞外基质紊乱是该免疫损伤模型的重要病理机制。而虫草多糖等药物明显抑制TGFβ1 与TGFβR1 的异常表达,同时减少肝窦星状细胞活化细胞骨架蛋白Dm的表达,抑制胶原的生成与沉积,提示虫草多糖抗肝纤维化的作用机理可能主要在于抑制肝星状细胞的活化及其TGFβ1 表达,至于其调控机理,尚需今后进一步研究。
参考文献（略） | |
